Krok 73: Používat vysoce kvalitní řezy
Pro IHC jsou požívány tenké rovné, správně vysušené řezy. Skla jsou buď nabitá, nebo potahovaná (silanizovaná).
Špatně natažené řezy se barví nerovnoměrně s variabilně obarveným pozadím.
Krok 74: Zajistit optimální fixaci
Kvalitní fixace za použití známých a konzistentních podmínek (druh fixativa, pH, teplota, čas) vede k nejlepším výsledkům. Vzorky by měly být před zpracováním zkontrolovány, aby se zjistilo, zda je potřeba další fixace nebo nikoliv.
Nekonzistentní podmínky fixace mají za následek nedofixované či naopak přefixované tkáně. To vede k variabilitě výsledků a problémům spojeným s hledáním řešení.
Krok 75: Zamezit problémům s přilnavostí řezů
Při napínání řezů v lázni se vyvarujeme použití adheziv na proteinové bázi (různá lepidla, škrob nebo želatina).
Taková adheziva mohou zablokovat povrch nabitého podložního sklíčka a zapříčinit špatnou přilnavost řezu. Následně mohou způsobit i zadržování IHC činidel pod nadzvednutými částmi tkáně. Výsledkem toho je nerovnoměrné barvení.
Krok 76: Optimalizovat odstraňování parafínu a používání činidel
Pro dosažení konzistentních výsledků je třeba optimalizovat deparafinaci a hydrataci řezů a dávkování a rovnoměrnou distribuci činidel po povrchu tkáně.
Neúplné odstranění parafínu může vést ke vzniku špatně zbarvených oblastí v řezech.
Krok 77: Vyhnout se koncentračním gradientům
Koncentračnímu gradientu se lze vyhnout správnou aplikací reagencií na sklo.
„Občas pozorujeme, že jeden konec řezu je obarven více než druhý.“
Krok 78: Pečlivě vybírat protilátku
Při výběru protilátky klademe důraz zejména na citlivost a specifitu. Protilátky nabízené různými dodavateli pod různými názvy mohou pocházet z téhož zdroje. Při hodnocení protilátky je nutno použít název klonu.
„Zajímá nás pouze cena produktu.“
Krok 79: Číst návody k protilátkám
Návod by měl být přiložen k protilátce nebo by měl být volně ke stažení na internetu. V tomto dokumentu by měla být uvedena základní metodika k použití protilátky. Se zakoupením nové šarže protilátky by se měla provádět kontrola případných změn.
„Nemáme přístup k návodům od protilátek.“
Krok 80: Optimalizovat odmaskovací metody
Pro jednotlivé protilátky jsou stanoveny vhodné podmínky pro odmaskování epitopu (pH, pufry, teplota, čas, tlak).
„Předpokládáme, že existuje univerzální HIER metoda a pro všechny primární protilátky používáme tutéž odmaskovací metodu.“
Krok 81: Brát v úvahu křížovou reaktivitu protilátek
Bereme v úvahu možné problémy způsobené křížovou reaktivitou protilátek (přečteme si specifikační list).
Nesnažíme se vysvětlit, proč při barvení došlo k neočekávané pozitivní reakci ve strukturách, které by pozitivní být neměly.
Krok 82: Blokovat endogenní peroxidázy
U detekčních systémů využívajících křenovou peroxidázu je třeba blokovat endogenní peroxidázu, aby nedošlo k falešně pozitivní reakci tkáně.
Nespecifické barvení lze často pozorovat v erytrocytech, granulocytech, monocytech a ve svalech a je způsobeno nekompletním blokováním endogenní peroxidázy.
Krok 83: Předcházet falešnému barvení pozadí
Vždy je používán adekvátní Protein-Blok.
Nespecifické zbarvení pozadí je občas přítomno kvůli nedostatečnému blokování proteinů.
Krok 84: Používat vhodný detekční systém
Vhodný detekční systém zajistí přesné specifické barvení s odpovídající citlivostí.
„Používáme jeden detekční systém už dlouhou dobu a nemáme důvod jej měnit. Některá barvení jsou slabá nebo neostrá, ale s tím už počítáme.“
Krok 85: Standardizovat promývání
Konzistentních výsledků je dosaženo, pokud jsou dodrženy podmínky promývání mezi jednotlivými kroky (čas, objem pufru a intenzita promývání.
Pokud jsou výsledky velmi variabilní v rámci jednoho barvícího cyklu se stejnou protilátkou i mezi cykly prováděnými v různých dnech, může to být způsobeno různými promývacími technikami, které požívají různí laboranti.
Krok 86: Optimalizovat dobarvení jader
Síla jaderného barvení je nastavena tak, aby nedocházelo k zastínění slabého pozitivního (specifického) barvení. Dobarvení by mělo poskytnout nejlepší možný kontrast mezi chromogenem a pozadím tkáně. Pro každý použitý chromogen se zvolí vhodná metoda dobarvení (hematoxylin, jádrová červeň, methylzeleň apod.).
Jádra jsou někdy přebarvena a intenzivní barvení může způsobit překrytí slabého specifického signálu.
Krok 87: Používat vhodnou kontrolu
Použití vhodných pozitivních a negativních kontrol vede ke kvalitnímu ověření výsledků barvení. Vnitřní pozitivní a negativní kontroly jsou také důležité a nabízejí výtečný způsob, jak zajistit kvalitu v IHC.
„Provádíme kontroly, pouze když se zdá, že naše metoda nefunguje. Kdybychom je udělali na každém skle, stálo by to moc peněz a stejně by se na ně nikdo nedíval.“
Krok 88: Výsledky vyhodnocovat opatrně
Je nám dobře známo, co a kde máme hledat při vyhodnocování výsledků barvení vzorků i kontrol.
Spokojíme se s tvrzením, že uspokojivý výsledek barvení je takový, kde je cokoliv jakkoliv obarveno.
