Krok 89: Používat vysoce kvalitní řezy
Používáme tenké rovné řezy, které byly řádně vysušeny. Pro ISH experimenty upřednostňujeme pozitivně nabitá sklíčka.
Špatně přilnavé řezy se barví nerovnoměrně s variabilně obarveným pozadím.
Krok 90: Zajistit optimální fixaci
Kvalitní fixace za použití známých a konzistentních podmínek (druh fixativa, pH, teplota, čas) vede k nejlepším výsledkům.
Nekonzistentní podmínky fixace mají za následek nedofixované či naopak přefixované tkáně. To vede k variabilitě výsledků a problémům spojeným s hledáním řešení.
Krok 91: Zamezit problémům s přilnavostí řezů
Při napínání řezů v lázni se vyvarujeme použití adheziv na proteinové bázi (různá lepidla, škrob nebo želatina).
Taková adheziva mohou zablokovat povrch nabitého podložního sklíčka a zapříčinit špatnou přilnavost řezu. Následně mohou způsobit i zadržování ISH činidel pod nadzvednutými částmi tkáně. Výsledkem toho je nerovnoměrné barvení.
Krok 92: Optimalizovat odstraňování parafínu a dávkování činidel
Pro dosažení konzistentních výsledků je třeba optimalizovat deparafinaci a hydrataci řezů a dávkování a rovnoměrnou distribuci činidel po povrchu tkáně.
Neúplné odstranění parafínu může vést ke vzniku špatně zbarvených oblastí v řezech. Také bubliny, které se utvoří na povrchu tkáně při odmaskování nebo při aplikaci činidel na tkáň, mohou způsobit problémy.
Krok 93: Pečlivě vybírat hybridizační sondu
Při výběru hybridizační sondy klademe důraz zejména na citlivost a specifitu.
„Zajímá nás pouze cena produktu“
Krok 94: Číst návody k sondám
Návod by měl být přiložen k sondě nebo by měl být volně ke stažení na internetu. Z návodu se dozvíte základní metodiku, která je pro tu kterou sondu nejvhodnější. Pečlivě zkontrolujte teplotu a čas hybridizace, které povedou k maximální specifické vazbě sondy.
„Nemáme přístup k návodům od sond, používáme jen jednu jedinou metodu.“
Krok 95: Optimalizovat pretreatment
Pro jednotlivé sondy jsou stanoveny vhodné podmínky pro pretreatment (pH, pufry, enzym, teplota, čas). Ty závisí zejména na fixaci a typu tkáně.
Použití stejného enzymového pretreatmentu pro všechny sondy, může vést k chybným výsledkům.
Krok 96: Šetrně zacházet se vzorky
Šetrné zacházení s tkáněmi a rychlá fixace omezí ztrátu RNA působením endogenních RNáz.
Nesprávná manipulace se vzorky tkáně a opožděná fixace prohlubuje ztrátu RNA působením endogenních RNáz.
Krok 97: Používat vhodný detekční systém
Vhodně zvolený, citlivý detekční a vizualizační systém s optimálními inkubačními kroky zajistí přesné specifické barvení s odpovídající citlivostí
Nedostatečná citlivost detekčního a vizualizačního systému může vést k velmi slabému nebo dokonce negativnímu barvení, a to i přesto, že je sonda vázána na cíl.
Krok 98: Zamezit vypařování činidel
Použití správné techniky zabraňující odpařování sondy je zásadní pro správný průběh hybridizace. Dlouhé inkubační časy s sebou nesou riziko vyschnutí reagencie na řezu.
Pokud sonda nebo jiná činidla během inkubace vyschnou (obvykle na okrajích řezu), projeví se to jako výrazné nespecifické barvení.
Krok 99: Standardizovat promývání
Konzistentních výsledků je dosaženo, pokud jsou dodrženy podmínky promývání mezi jednotlivými kroky (čas, objem pufru a intenzita promývání).
Pokud jsou výsledky velmi variabilní v rámci jednoho barvícího cyklu se stejnou sondou i mezi cykly prováděnými v různých dnech, může to být způsobeno různými promývacími technikami, které používají různí laboranti.
Krok 100: Používat vhodnou kontrolu
Použití vhodných kontrol vede ke kvalitnímu ověření výsledků barvení. To zahrnuje použití pozitivní kontrolní tkáně a negativní kontrolou by měla být nespecifická sonda.
„Provádíme kontroly, pouze když se zdá, že naše metoda nefunguje. Kdybychom je udělali na každém skle, stálo by to moc peněz a stejně by se na ně nikdo nedíval.“
Krok 101: Výsledky vyhodnocovat opatrně
Je nám dobře známo, co a kde máme hledat při vyhodnocování výsledků barvení vzorků i kontrol. Každý, kdo se zabývá ISH, by měl mít alespoň základní povědomí o technice a umět nalézt pozitivní barvení.
Spokojíme se s tvrzením, že uspokojivý výsledek barvení je takový, kde je cokoliv jakkoliv obarveno.
